 |
Методика иммуноферментного анализа
Метод иммуноферментного анализа (ИФА) основан на высокой избирательности и специфичности иммунологических реакций “антиген-антитело”. Мишенью для тест-систем могут быть иммуноглобулины, гормоны белковой и стероидной природы, структурные и транспортные белки, липопротеины, гликопротеины и другие высокомолекулярные биологические соединения.
Метод ИФА состоит из трех стадий:
1. На поверхности лунки планшета, сорбирован белок - антиген инфекционного агента или антитело к нему. В лунку вносится исследуемый биологический материал, чаще всего сыворотка крови больного. Если в ней содержатся антитела к данному инфекционному агенту или антигены (сами инфекционные агенты), то они образуют иммунные комплексы “антиген-антитело” и остаются связанными при последующей промывке. На этом первая стадия заканчивается. Это основная — “специфическая” стадия процесса. Последующие стадии нужны лишь для выявления образовавшегося иммунного комплекса.
2. На второй стадии анализа в лунку вносят комплекс, состоящий из антитела и фермента (т.н. конъюгат), способный связываться с образовавшимися иммунными комплексами. Если в ячейке имеются образовавшиеся на первой стадии процесса иммунные комплексы, то конъюгат с ними связывается.
3. На следующей стадии в лунку добавляется раствор бесцветного вещества — хромогена. Это вещество приобретает окраску после расщепления его присутствующим в ячейке ферментом. То есть, если все элементы цепочки присутствуют, в лунке образуется окрашенный комплекс. Произошедшая цветовая реакция полностью пропорциональна предшествующей иммунологической, что позволяет выявить и количественно измерить в исследуемом биологическом материале искомый антиген или антитело.
Рекомендации по постановке ИФА-анализа на тест-системах производства ЗАО “Медико-Биологический союз”
- Каждый образец сыворотки следует отбирать новым наконечником.
- Для иммуноферментного анализа должны использоваться прозрачные сыворотки, поскольку при учете результатов измеряется оптическая плотность.
- Если сыворотка содержит какой-либо осадок, ее необходимо осветлить центрифугированием.
- Нельзя использовать сыворотки с выраженным гемолизом или с бактериальным проростом.
- Нельзя допускать повторных циклов оттаивания-замораживания образцов сывороток.
- При подготовке реагентов к постановке анализа внимательно следуйте инструкции!
- При проведении анализа нельзя использовать компоненты из наборов разных серий.
- При работе с компонентами набора и исследуемыми образцами работать только в резиновых перчатках. По окончании работы обязательно тщательно вымыть руки.
- ТМБ и ОФД являются светочувствительными реагентами. Поэтому сразу после приготовления рабочего раствора субстрата следует поместить его в защищенное от света место.
- При работе с таблетками ОФД и ТМБ могут разлагаться под действием окисляющих агентов, ионов металлов и даже следов моющих средств. Поэтому:
- Таблетки ОФД нельзя отбирать металлическим пинцетом.
- Концентрат ТМБ должен отбираться из флакона новым наконечником.
- Для работы с растворами ТМБ и ОФД целесообразно выделить отдельную посуду, желательно одноразовую.
- Если возникает необходимость в повторном использовании посуды, предназначенной для работы с ОФД или ТМБ, то она должна мыться отдельно от другой посуды, без использования синтетических моющих средств. Сначала посуда промывается 76% раствором этилового спирта, после чего споласкивается дистиллированной водой.
- Для получения нужного количества рабочего раствора субстрата руководствуйтесь таблицей 2 инструкции по применению. Ни в коем случае недопустимо деление таблеток ОФД на части!
- Для работы применять автоматические пипетки с погрешностью измерения объёма не более 5 %.
- Каждый образец сыворотки или раствора необходимо отбирать новым наконечником.
- Инкубацию планшетов проводить при 37± 1 ° С. Нельзя проводить анализ при температуре в помещении ниже 18 ° С и выше 25° С!
- Необходимые для работы объемы коньюгата и ТМБ указаны на этикетках флаконов (V в мл). Не используйте для постановки анализа все содержимое флакона!
- Контроли К+ и К- готовы к использованию и не требуют дополнительного разведения!
- При разведении ФСБ-Т дистиллированной водой, важно следить за тем, чтобы температура воды не была слишком низкой (оптимальным будет использовании дистиллята комнатной температуры). Если во флаконе с ФСБ-Т есть осадок, следить за тем, чтобы при разведении он полностью растворился.
|
|
|
