|
|
|
|
|
|
|
|
||||||
| ГЛАВНАЯ / Для пользователей / Рекомендации по постановке ПЦР-анализа | ЗАДАТЬ ВОПРОС |
 |
Методика ПЦР анализа Исследуемым материалом для ПЦР могут служить соскобы эпителиальных клеток, кровь, сыворотка, плевральная и спинномозговая жидкости, моча, мокрота, слизь, биоптаты и другие биологические образцы. Забор клинического материала для исключения контаминации необходимо проводить с помощью стерильных, желательно, одноразовых, инструментов в одноразовые стерильные пластиковые пробирки (например, "Эппендорф") или тщательно вымытые (хромовой смесью) стеклянные пробирки и флаконы. При необходимости переноса образца используют только стерильные одноразовые наконечники! Поскольку есть вероятность разрушения ДНК или РНК в клиническом материале, срок хранения материала желательно минимизировать. Хранение любого клинического материала возможно не более 2 суток при температуре +4оС. При невозможности доставить образцы в ПЦР - лабораторию в течение этого времени, следует их заморозить и хранить при -20 оС. в течение года. Допускается только однократное кратковременное замораживание-оттаивание материала. 2. Выделение ДНК или РНК из клинического материала. На данном этапе образец клинического материала подвергается специальной обработке, во время которой происходит лизис клеток, устранение белковых и полисахаридных фракций. Для этого используется метод твердофазной сорбции, заключающийся в добавлении лизирующего раствора гуанидин-хлорида, сорбции ДНК (РНК) на сорбенте (силикагеле), многократной отмывке и ресорбции ДНК (РНК) буферным раствором. Результатом такой обработки является очищенный раствор, содержащий всю ДНК или РНК из клинического материала. Выбор набора для выделения ДНК (РНК) обычно определяется видом исследуемого клинического образца. ЗАО МБС разработаны универсальные наборы для выделения ДНК/РНК из любого исследуемого материала:
Детально методика выделения ДНК (РНК) из клинического образца описывается в инструкции, прилагаемой к набору реагентов. Полученный раствор ДНК (РНК) можно хранить в течение недели при температуре +2° С и 1 год при температуре -20оС. 3. Проведение обратной транскрипции. Для определения наличия РНК-содержащих вирусов (гепатит С, например) необходимо снять ДНК-копию с РНК вируса. Это проводят в реакции обратной транскрипции, с участием фермента обратной транскриптазы (ревертазы). В результате получается раствор, содержащий ДНК-копию РНК вируса (так называемая кДНК). Для проведения обратной транскрипции используйте “Набор для обратной транскрипции”. Детально методика обратной транскрипции описана в инструкции, прилагаемой к набору реагентов.
4. Проведение амплификации. Амплификация является ключевым этапом ПЦР. Каждый цикл амплификации включает три этапа, протекающие при различных температурных режимах:
В результате амплификации образуется очень большое количество копий специфического участка ДНК, только если клинический материал содержал ДНК соответствующего возбудителя. Для проведения амплификации небольшое (порядка 3,5 мкл) количество раствора ДНК из клинического материала переносят в пробирку для ПЦР, уже содержащую раствор праймеров под парафином “нижняя ПЦР-смесь”. В эту же пробирку добавляется “верхняя” ПЦР-смесь, состоящая из воды, ПЦР-буфера и раствора дНТФ; в последнюю очередь добавляется раствор Taq-полимеразы. Затем в пробирку добавляется одна капля минерального масла для предотвращения испарения реакционной смеси в процессе амплификации. Пробирки переносятся в амплификатор и проводится амплификация в автоматическом режиме по заданной программе (температура-время). Для удобства пользования все наборы для амплификации производства МБС имеют одинаковые универсальные программы амплификации. Время проведения реакции составляет 1-3 часа. Подробно описание методики и программы амплификации описаны в инструкциях, прилагаемых к наборам для амплификации. Для избежания ложноположительных и ложноотрицательных результатов в наборы для амплификации включают положительную ДНК; в качестве отрицательного контроля в одну из пробирок вместо раствора ДНК клинического материала добавляют эквивалентное количество воды. В наборы для амплификации входят: пробирки для ПЦР с праймерами “нижняя ПЦР-смесь”, пробирка с Taq-полимеразой, пробирка с ПЦР-смесью (верхней) “UP-PCR”, пробирка с минеральным маслом и пробирка с положительным контролем. 5. Регистрация результатов амплификации.Амплифицированный специфический фрагмент ДНК выявляют методом электрофореза в 2% агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Бромистый этидий образует с фрагментами ДНК устойчивое соединение внедрения, проявляющееся в виде светящихся полос при облучении геля УФ-излучением с длиной волны 290-330 нм. Для приготовления агарозного геля расплавляют в СВЧ-печи или на водяной бане смесь агарозы, буфера и воды, добавляют раствор бромистого этидия. Охлажденную до 50-60оС смесь тонким слоем заливают в форму и с помощью специальных гребенок делают в геле карманы для нанесения образца. После застывания геля в карманы наносится амплификат, уже содержащий лидирующий краситель. Форму с гелем, содержащим нанесенные образцы переносят в камеру для электрофореза, заполненную буфером, камеру подключают к источнику питания (напряжение 10-15 В/см длины геля), и проводят электрофоретическое разделение продуктов амплификации в направлении от катода к аноду. Контроль за электрофоретическим разделение осуществляется визуально по движению полосы красителя. Полоса красителя должна пройти от старта 1,5-2 см. По окончании электрофоретического разделения вынимают гель из формы и просматривают в ультрафиолетовом свете с помощью УФ-трансиллюминатора (желательно фотографируют). Фрагменты анализируемой ДНК проявляются в виде светящихся оранжево-красных полос. Результат оценивают по наличию в анализируемой пробе фрагмента ДНК, пятно которого располагается на том же уровне, что и пятно контрольного препарата ДНК. Положительными считаются образцы, которые содержат специфическую светящуюся полосу большей или меньшей интенсивности. В дорожке, соответствующей отрицательному контрольному образцу не должно быть специфической положительной полосы. При работе с материалом, содержащим много клеток, в ПЦР участвует большое количество неспецифической геномной ДНК. При этом в дорожках геля появляются характерные размытые полосы, равномерно располагающиеся от лунки до самого низа дорожки или концентрирующиеся около лунки. На таком фоне в положительном образце видна специфическая полоса, а в отрицательном образце полоса отсутствует.
Требования по организации работ в ПЦР-лабораториях сформулированы в “Методических рекомендациях по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции” (1995, Госэпиднадзор). |
|
|
|
© ЗАО "Медико-Биологический Союз" Отдел продаж: Тел./Факс: 8 (383) 339-91-97 Головной офис: Тел./Факс: 8 (383) 332-52-75, 332-54-78 |
|
Создание сайта Megaritm.RU |
