И.Н. МАНЗЕНЮК¹, М.С. ВОРОБЬЕВА¹, Н.М. НИКИТЮК¹, С.А. ФЕДОСОВ², М.А. ГОРБУНОВ¹, С.Н. ГНЕДОЙ¹, В.И. ЛОСЕВ², Н.А. КРИВЕНЧУК⁴

Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медико-биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича¹, ЗАО "МБС"", ООО "Биоагромед"", ЗАО "ИМДИ"⁴, Москва

I.N. MANZENYUK, M.S. VOROBYEVA, N.M. NYIKITYUK, S.A. FEDOSOV, MA CORBUNOV, S.N. GNEDOY, V.I. LOSEV,

N.A. KRYVENCHUK -

L.A.Tarasevich Slate Research Inslilule of Standardization and Drugs Conlrole, ZAO "MBS", OOO "Bioagromed", ZAO "IMDI", Moscow

По оценке ВОЗ среди заболеваний, передающихся половым путем, урогенитальный хламидиоз занимает второе место после трихомонадных инфекций. Более 90 млн новых случаев инфицирования Chlamydia trachomatis происходит ежегодно в мире, а экономический ущерб составляет 2,4 млрд долларов [1—3].

Выраженный полиморфизм клинических проявлений значительно осложняет диагностику хламидиозов. Из-за малочисленности симптомов и, как следствие, несвоевременности диагностики заболевание нередко приобретает хроническое течение, приводя к развитию разнообразных осложнений [2]. Значение С.trachomatis в инфекционной патологии человека определяется многоочаговыми поражениями мочеполовой системы (уретритами, эпидилимитами, простатитами, цервицитами, сальпингитами и т.д.), а также экстрагенитальным хламидиозом (фарингиты, коньюнктивиты, пневмонии новорожденных, болезнь Рейтера). У женщин несвоевременная диагностика и лечение инфекций, связанных с С.trachomatis, приводят к серьезным нарушениям репродуктивной функции и осложнениям (воспалительные заболевания органов малого таза, преждевременные роды, эктопическая беременность, бесплодие). Кроме того, инфицирование C.trachomatis увеличивает риск проникновения ВИЧ-инфекции [4]. Широкий спектр клинической патологии, вызываемый данным возбудителем, подробно описан в отечественной и зарубежной литературе [5, 6].

Решающее значение в выявлении хламидийных инфекций принадлежит методам лабораторной диагностики, которые включают в себя и данные серологии (обнаружение различных классов антихламидийных антител). В то же время, необходимо учитывать, что серологические методы имеют второстепенное значение в диагностике острой хламидийной инфекции, так как уровни антихламидийных антител не высоки. Но они успешно используются при тяжелых воспалительных заболеваниях урогенитальной сферы, при постановке диагноза хронических последствий инфекций, вызванных C.trachomatis (осложнений), когда другие методы лабораторной диагностики не эффективны и не позволяют выявить антигены, ДНК C.trachomatis или живые микроорганизмы [2, 7, 8]. Современными направлениями в лабораторной диагностике инфекций, вызванных C.trachomatis, становится комплексный подход - использование комбинаций различных диагностических тестов для скрининга и подтверждения инфицирования C.trachomatis.

Данная работа посвящена описанию первой отечественной иммуноферментной тест-системы для выявления IgG к C.trachomatis, прошедшей государственные испытания в ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

В работе использовали: рекомбинантный антиген, полученный путем амплифицирования и клонирования фрагмента гена MOM Р, кодирующего С-концевой полипептид в составе плазмиды pGEM-T, с последующим переклонированием вставки в экспрессирующий вектор рЕТ-15Ь и трансформацией в штамм E.coli BL2I (DE3). Очищенный рекомбинантный антиген использовали в качестве антигена для сенсибилизации твердой фазы при создании экспериментально-производственных серий иммуноферментной тест-системы "Хлами-IgG-ДС-Тr", предназначенной для выявления видоспецифических антител класса G к C.trachomatis в сыворотке крови человека методом непрямого иммуноферментного анализа. Данная тест-система разработана ЗАО "Медико-биологический союз" (МБС) совместно с НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ "Вектор", ООО "Биоагромед" и ЗАО "ИМДИ".

В качестве референс-тест-системы, любезно предоставленной представительством в Москве фирмы "Labsystems" (Финляндия), использовали " Chlamydia trachomatis IgG EIA Test". Государственные испытания были проведены в ГИСК им. Л.А. Тарасевича в условиях шифрованного опыта. Материалом исследования служили 180 сывороток крови от больных хламидиозом или здоровых лиц, полученных в медицинских учреждениях Москвы и Новосибирска.

Для анализа антихламидийных антител использовали метод иммуноферментного анализа, согласно прилагаемым к наборам инструкциям. При получении рекомбинантного антигена C.trachomatis все манипуляции с ДНК, включая электрофоретический анализ, обработку эндонуклеазами рестрикции, лигирование, трансформацию, экспрессию и наработку антигена в виде телец включения, содержащих рекомбинантный белок, осуществляли согласно руководству [9]. Статистическую обработку результатов проводили в соответствии с рекомендациями И.П. Ашмарина и А.А. Воробьева [10].

Для создания отечественной тест-системы для выявления видоспецифических антител класса G к C.trachomatis был использован рекомбинантный антиген хламидий.

Анализ зарубежной литературы [11, 12] показал, что использование рекомбинантных белков или синтетических пептидов позволяет существенно повысить чувствительность и специфичность разработанных ИФА-тест-систем. Например, широко распространенная в мире коммерческая ИФА-тест-система для выявления видоспецифических антител к C.trachomatis фирмы "Labsystems" (Финляндия) разработана на основе синтетических пептидов. Аналогичные тест-системы разработаны фирмами "Savyon Diagnostics Ltd" (Израиль) и "Medac" (Германия). Важно подчеркнуть, что у данных тест-систем отсутствует перекрест к антителам Chlamydia pneumoniae, что особенно важно, учитывая, что у 80—90% людей с возрастом наблюдаются различные уровни антител к C.pneumoniae.

Согласно данным ряда исследователей, основной белок наружной мембраны (МОМР — Major Outer Membrane Protein или ОМР-1) обладает выраженными иммуногенными свойствами. Он экспонирован на поверхности хламидийных клеток, составляя около 60% суммарного поверхностного белка и является основным серотипирующим иммуногенным антигеном C.trachomatis. Известна полная нуклеотидная последовательность данного белка, хорошо изучена его доменная структура [3, 4]. Это позволило нам оптимально подобрать праймеры к фрагменту белка, содержащего видоспецифические эпитопы, клонировать соответствующий участок гена. Использование плазмиды семейства рЕТ позволило получить рекомбинантный продукт, содержащий на С-конце гистидиновый 6-членный пептид. Наличие поли-His обеспечило аффинитет рекомбинантного белка к Ni-нитрилацетат-сефарозе (Ni-NTA-агароза), что сделало возможным последующую аффинную очистку рекомбинантного белка. Результаты электрофореза аффинно-очищенного рекомбинантного белка представлены на рисунке. Денситометрия белковых полос элюата показала, что чистота антигенного препарата составляет не менее 95%. Полученный рекомбинантный белок МОМР C.trachomatis не обладал перекрестными реакциями к антителам к Chlamydia psittaci и C.pneumoniae.

Таким образом, был впервые получен высокоочищенный видоспецифический рекомбинантный антиген, который был использован в качестве сенсибилизирующего компонента для планшетов новой отечественной тест-системы "Хлами-IgG-ДС-Тr".

Предварительное изучение экспериментально-производственных серий данной системы показало перспективность применения рекомбинантного антигена для повышения чувствительности и специфической активности препарата.

Дорожки: 1 — Молекулярные стандарты (14,3 кДа, 25 кДа,
30 кДа. 43 кДа. 67 кДа); 2 — тотальная солюбилизирован-
ная фракция; 3 — проскок на Ni-NTA-агарозе; 4 — повтор
ная солюбилизация осадка; 5— промывка сорбента, рН 8,0;
6—8— промывка сорбента, рН 6,3; 9—20— элюция МОМР,
рН 6,3 — 250 мМ имилазола.
Окраска Кумасси R-250.

Данные изучения стабильности тест-системы показали, что испытуемая тест-система стабильна при хранении и устойчива к перепадам температур. Так, при хранении тест-систем "Хлами-IgG-ДС-Tr" при 2—10 °С в течение 4 месяцев уровень сигналов снижается на 5—10% от исходных значений. Термодеградационный тест показал, что при выдерживании данной тест-системы при 37 °С в течение 11 дней уровень сигналов снижается в среднем на 15%, а при хранении тест-системы с перепадами температур (18 часов при -12 °С, 6 часов — при 37 °С) в течение трех суток уровень сигналов снижается в среднем на 30%. При этом чувствительность и специфичность во всех сериях после хранения при различных режимах не меняется, что характеризует высокую стабильность тест-системы при хранении и транспортировке к потребителю.

Новая тест-система была изучена нами в клинических условиях. Испытания проводили в условиях шифрованного строго контролируемого опыта. Предварительно перед формированием опытной и контрольной групп сыворотки крови больных и здоровых лиц были исследованы в референс-тест-системе "Labsystems" (Финляндия) — " Chlamydia trachomatis IgG EIA Test", после чего были отобраны положительные и отрицательные сыворотки, содержащие и не содержащие IgG к С.trachomatis.

В опытную группу были включены положительные сыворотки от больных с различными поражениями внутренних органов и мочеполовой системы хламидийной этиологии (60 образцов). В эту группу вошли больные с урогенитальными хламидиозами и их осложнениями (простатиты, проктиты, сальпингиты, непроходимость труб, эндометриты, бесплодие, эндоцервициты), поражением суставов.

В контрольную группу были включены отрицательные сыворотки (60 образцов) от больных людей с различными поражениями внутренних органов и мочеполовой системы нехламидийной этиологии (пневмонии, бронхиты, ОРЗ, артриты, гепатиты В и С, нефриты, урогенитальные инфекции). Кроме этого, в данную группу вошли отрицательные сыворотки (60 образцов) от здоровых людей, без клинических жалоб. Итого, данная группа была представлена 120 образцами сывороток.

Сыворотки от лиц опытной и контрольной групп до начала работ хранились при —20 °С. Все 180 образцов сывороток исследовали в испытуемой иммуноферментной тест-системе "Хлами-IgG-ДС-Тг", серия № 18, в соответствии с инструкцией по применению. Опыты были проведены в период срока годности препаратов.

Просле проведения исследований сыворотки были расшифрованы и распределены на соответствующие группы для оценки чувствительности, специфичности и воспроизводимости (таблица). Вычисляли показатели чувствительности, специфичности, воспроизводимости в % для испытуемой тест-системы в сравнении с референс-тест-системой.

Опытная группа (чувствительность)

Положительные сыворотки от больных различными формами хламидиоза, вызванного

C.trachomatis 58/60 96,7

Контрольная группа (специфичность)
Отрицательные сыворотки на IgG к С.trachomatis от здоровых доноров 59/60 98,3

Отрицательные сыворотки на IgG к С.trachomatis от больных с различной инфекционной

и соматической патологией 57/60 95,0

Суммарная специфичность 116/120 96,7

Анализ сывороток, позитивных на наличие антител IgG к C.trachomatis, как было установлено в референс-тест-системе, выявил, что 2 сыворотки из 60 образцов были отрицательны в испытуемой тест-системе: ОП 0,067 и ОП 0,092 при ОП_крит 0,290. Таким образом, чувствительность испытуемой тест-системы по отношению к референс-тест-системе составила 96,7%.

Анализ сывороток, отрицательных на наличие антител IgG к C.trachomatis, как было установлено в референс-тест-системе, выявил, что 4 сыворотки из 120 бразцов были слабоположительны в испытуемой тест-системе: ОП 0,400, ОП 0,383, ОП 0,367 и ОП 0,323 при ОП_крит 0,290 и ОП_крит 0,279. Таким образом, специфичность испытуемой тест-системы по отношению к референс-тест-системе составила 96,7%.

Воспроизводимость оценивали путем троекратной постановки шифрованных сывороток (10 положительных и 10 отрицательных образцов). Воспроизводимость испытуемой тест-системы составила 100%.

Таким образом, разработанная коллективом авторов тест-система "Хлами-IgG-ДС-Тr" обладает хорошими эксплуатационными характеристиками: удобна в использовании, стабильна, имеет низкую стоимость по сравнению с импортными аналогами, позволяет одновременно тестировать до 96 образцов, включая контрольные, время постановки реакции не превышает двух часов, наличие цветовой реакции при внесении образцов исключает ошибки при постановке реакции, наличие стриппованного планшета дает возможность ставить реакции по мере поступления образцов.

Проведенные исследования показали, что тест-система "Хлами-IgG-ДС-Тr" фирмы "МБС" по своей специфичности, чувствительности и воспроизводимости, т.е. по диагностической эффективности не уступает зарубежной коммерческой тест-системе ("Labsystems", Финляндия, "Chlamydia trachomatis IgG EIA Test") и может быть рекомендована для серологической диагностики инфекций, вызванных C.trachomatis, в практической медицине. Данный метод полезен для диагностики осложненных и хронических хламидийных инфекций. Удобная система интерпретации результатов, предложенная в инструкции по применению, позволяет более правильно поставить диагноз.

Невысокий уровень IgG в сыворотке человека может свидетельствовать о ранее перенесенной инфекции или проведенной терапии антибиотиками, после чего длительно, до 3—6 месяцев, сохраняются антитела в крови. Обнаружение четкого нарастания IgG в парных сыворотках в 2—4 раза от первоначального уровня свидетельствует об активном течении инфекционного процесса. В этом случае необходимо параллельное исследование на IgA, высокие уровни которого наиболее часто свидетельствуют об обострении хронической хламидийной инфекции.