С 1995 года ЗАО “Медико-биологический Союз ( ЗАО“MБС” ), совместно с НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ “ВЕКТОР”, проводили работу по созданию группы ИФА тест-систем на выявление хламидиоза, которые бы не уступали по качеству продукции ведущих иностранных фирм. Эта работа посвящена краткому описанию результатов испытаний отечественной иммуноферментной тест-системы для выявления IgG к Chl.trachomatis, единственной на сегодняшний день, успешно прошедшей Государственные испытания в ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

По данным ВОЗ, среди заболеваний, передающихся половым путем, урогенитальный хламидиоз стоит на втором месте. Более чем 89 миллионов новых случаев инфицирования Chl.trachomatis происходит ежегодно в мире. Экономический ущерб, наносимый этим заболеванием, составляет миллиарды долларов. Chl.trachomatis увеличивает риск проникновения ВИЧ инфекции [1, 2].

Видоспецифическая иммуноферментная тест-система для выявления IgG к Chlamydia trachomatis “Хлами-IgG-ДС-Тr”. И.Н. Манзенюк, Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля МБП им. Л.А. Тарасевича

С.А. Федосов, НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ “Вектор”; М.В. Лосев, ЗАО “МБС”; С.Н. Гнедой, ООО “Биоагромед”

Выраженный полиморфизм клинических проявлений и отсутствие опорных симптомов значительно осложняют клиническую диагностику хламидиоза. Из-за малочисленности симптомов и, как следствие, несвоевременности диагностики, заболевание нередко приобретает хроническое течение, приводя к развитию разнообразных осложнений [3].

Значение урогенитального хламидиоза в инфекционной патологии человека определяется непосредственными многоочаговыми поражениями мочеполовой системы (уретритами, эпидидимитами, простатитами, цервицитами, сальпингитами и т.д.). Хламидийная инфекция у женщин связана с серьезными нарушениями репродуктивной функции и инфекционными осложнениями, такими, как воспалительные заболевания органов малого таза, преждевременные роды, бесплодие. Растет заболеваемость экстрагенитальным хламидиозом (проктиты, фарингиты, конъюнктивиты, пневмонии новорожденных, поражение суставов — болезнь Рейтера). Широкий спектр клинической патологии, вызываемой данным возбудителем, хорошо описан в отечественной и зарубежной литературе [1, 4].

Решающее значение в выявлении хламидийной инфекции принадлежит методам лабораторной диагностики. Лабораторная диагностика при хламидиозе основана на прямом методе исследования: выявление возбудителя, его антигенов или ДНК и данных серологических исследований: обнаружение антихламидийных антител.

Серологическая диагностика имеет второстепенное значение в диагностике острой хламидийной инфекции, когда уровни антихламидийных антител не высоки. Но ее успешно применяют в случаях тяжелых воспалительных заболеваний урогенитальной сферы, в установлении диагноза хронических последствий инфекций, вызванных Chl.trachomatis (осложнений), когда другие методы лабораторной диагностики не эффективны и не выявляют антигены Chl.trachomatis или живых микроорганизмов. Современными направлениями в лабораторной диагностике инфекции, вызванной Chl.trachomatis, становится комплексный подход, использование комбинации различных диагностических тестов для скрининга и подтверждения.

ЗАО “МБС” совместно с НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ “Вектор”, ООО “Биоагромед” разработана тест-система для выявления видоспецифических иммуноглобулинов класса G к Chlamydia trachomatis в сыворотке крови человека методом иммуноферментного анализа (ИФА).

Материалы и методы

В работе использованы экспериментально — производственные серии иммуноферментной тест-системы “Хлами — lgG-ДС-Тг”, производства ЗАО “МБС”. В связи с отсутствием в России аттестованных иммуноферментных диагностических тест-систем для выявления антител класса G на хламидийную инфекцию, в качестве референс-тест-системы использовали “Chlamydia trachomatis IgG EIA Test” Labsystems, Финляндия. Государственные испытания были проведены в ГИСК им. Л.А. Тарасевича в условиях шифрованного опыта. Материалом исследования служили сыворотки крови больных хламидиозом или здоровых лиц, полученные в медицинских учреждениях гг. Москвы и Новосибирска.

Результаты и обсуждение

Использование рекомбинантных белков или синтетических пептидов позволило повысить чувствительность и специфичность разработанных ИФА-тест-систем. Первой зарубежной видоспецифической ИФА-тест-системой для выявления антител к Chl.trachomatis стал коммерческий диагностикум фирмы “Лабсистемс”, разработанный на основе синтетических пептидов. У данной тест-системы отсутствует перекрест к Chl.pneumonia антител, что особенно важно, учитывая, что у 80-90% людей с возрастом наблюдают различные титры антител к этому возбудителю.

В процессе разработки тест-системы “Хлами -lgG-ДС-Тr” была проведена сравнительная оценка различных антигенов Chlamydia trachomatis отечественного производства. Неудовлетворительное качество природных антигенов, нестабильность и нестандартизованность партий антигена обусловили выбор в качестве сенсибилизирующего антигена — видоспецифического рекомбинантного белка Chlamydia trachomatis.

Согласно данным ряда исследователей, основной белок наружной мембраны (MOMP-Major Outer Membrane Protein) обладает выраженными иммуногенными свойствами. Он экспонирован на поверхности хламидийных клеток, составляет около 60% суммарного поверхностного белка и является принципиальным серотипирующим иммуногенным антигеном Chlamydia trachomatis. Известна полная нуклеотидная последовательность данного белка, хорошо изучена его доменная структура.

С помощью генно-инженерных методов был получен специфический рекомбинантный белок МОМР Chlamydia trachomatis серовар L2, не обладающий перекрестными реакциями с антителами к Chl.psittacy и Chl.pneumonia.

Использование высокоочищенного видоспецифического рекомбинантного антигена позволило повысить чувствительность и специфичность тест-системы “Хлами -lgG-ДС-Тr”. Тест-система предназначена для выявления антител класса G к Chlamydia trachomatis методом непрямого иммуноферментного анализа. Контроль трех серий и проведенные государственные испытания выявили высокую чувствительность и специфичность “Хлами-lgG-ДС-Тr”.

Материалом исследования служили сыворотки крови больных хламидиозом или здоровых лиц. Сыворотки перед формированием были подвергнуты скринингу референс-тест-системой — Labsystems, Финляндия "Chlamydia trachomatis IgG EIA Test". Таким образом, были отобраны положительные (опытная группа) и отрицательные (контрольная группа) сыворотки с наличием или отсутствием IgG к Chlamydia trachomatis.

В опытную группу были включены: сыворотки крови больных хламидиозом с различными поражениями внутренних органов и мочеполовой системы - 60 образцов, полученные из медицинских учреждений гг. Москвы и Новосибирска. В эту группу вошли больные с урогенитальным хламидиозом и его осложнениями (простатиты, проктиты, трубная непроходимость, эндометриты, бесплодие, эндоцервициты), больные с пневмониями и заболеваниями верхних дыхательных путей.

В контрольную группу были включены: сыворотки крови (60 образцов) больных людей с различными поражениями внутренних органов и мочеполовой системы нехламидийной этиологии (пневмонии, бронхиты, ОРЗ, артриты, гепатиты В и С, нефриты, урогенитальные инфекции нехламидийной этиологии, больные у которых этиологическим фактором заболевания являются представители хламидий других видов и т.д.). В данную группу вошли также отрицательные сыворотки крови (60 образцов) здоровых людей, без клинических жалоб. Итого — данная группа была представлена 120 образцами сывороток.

Государственные испытания были проведены в соответствии с требованиями контролируемого полевого опыта.

Сыворотки крови опытной и контрольной групп были зашифрованы сотрудниками ГИСК им. Л.А. Тарасевича и до начала работ сохранены при -20° С.

Все 180 образцов сывороток (таблица) исследовали в испытуемой иммуноферментной тест-системе “Хлами - IgG - ДС - Тr” серия №18, в соответствии с инструкциями по применению. Опыты были проведены в период срока годности препаратов.

После проведения исследований сыворотки были расшифрованы и распределены на соответствующие группы для оценки чувствительности, специфичности (таблица), которая составила по отношению к референс-тест-системе" 96,7%.

Результаты испытаний показали, что тест-система обладает хорошими эксплуатационными характеристиками: удобна в использовании, имеет низкую стоимость* по сравнению с импортными аналогами, позволяет одновременно тестировать до 96 образцов, включая контрольные, время постановки реакции не превышает 2-х часов, наличие цветовой реакции при внесении образцов исключает ошибки при постановке реакции, наличие стриппованного планшета дает возможность ставить реакции по мере поступления образцов. Наличие удобной системы интерпретации результатов (по выявленной оптической плотности - ОП образца), предложенной в инструкции по применению, позволяет правильно поставить диагноз и назначить соответствующее лечение.

* цена набора “Chlamydia trachomatis IgG EIA Test” Ladsystems (Финляндия) составляет 250 долларов США.

Таблица

Результаты испытания чувствительности и специфичности иммуноферментной тест-системы "Хлами-IgG-ДС-Тr"
на сыворотках, предварительно отобранных с помощью референс-тест-системы Labsystems (Финляндия) “Chlamydia trachomatis IgG EIA Test”

На основании результатов, полученных при проведении государственных испытаний, ГИСК им. Л.А.Тарасевича рекомендует внедрение в практику здравоохранения тест-системы иммуноферментной “Хлами - IgG - ДС - Тr”, разработанной ЗАО “МБС”.

P.S. В дополнение необходимо отметить, что выбор метода диагностики зависит от клинической формы хламидийной инфекции. Наличие невысоких уровней IgG в сыворотке крови человека может свидетельствовать о ранее перенесенной инфекции, проведенной терапии антибиотиками и т.д. из-за длительного (до 3-6 месяце) сохранения антител в крови. Четкое нарастание IgG в парных сыворотках (в 3-4 раза от первоначального уровня) свидетельствует об активном течении хламидийной инфекции. В этом случае необходимо параллельное исследование на IgA или IgM. Высокий уровень IgA говорит либо об активном течении хламидийной инфекции, либо о рецидиве хламидиоза. Наличие IgM антител свидетельствует о начальной стадии активации гуморального ответа. Создание ИФА-тест-систем для детекции IgM антител наталкивается на ряд проблем. Так, циркулирующий ревматоидный фактор (IgM анти IgG) обусловливает ложноположительные результаты, а негативные результаты могут быть причиной чрезмерного количества специфических IgG. В то же время IgM в ряде случаев не могут быть выявлены у подростков и взрослых при острой инфекции из-за предыдущего инфицирования Chl.trachomatis или, возможно, другими видами Chlamydia, такими, как Chl.pneumonia. В тоже время, выявление IgM к Chl.trachomatis является одним из основных серологических тестов для диагностики хламидийных пневмоний у новорожденных детей, а также у пациентов с LVG (венерической лимфогранулемой).

В настоящее время ЗАО "МБС" ведет разработку тест-систем на выявления IgA и IgM антител к C.trachomatis и тест-систем на выявление антител к Chl.psittacy и Chl.pneumonia.

ЗАО “МБС”: 630055, Новосибирск, ул. Смены, 4. Тел./факс: (3832) 39-94-42, 39-94-43

ЛИТЕРАТУРА

1. Хламидиоз. Клиника, диагностика, лечение. Методические рекомендации. — Москва, 1996. — 22 с.

2. Carolin M. Black “Current Methods of laboratory Diagnosis of Chlamydia trachomatis infections”, Clinical Microbiology Reviews. — Jan 1997. — P. 160-184.

3. Кротов СА., Кротова ВА., Юрьев С.Ю. Хламидиозы: эпидемиология, характеристика возбудителя, методы лабораторной диагностики, лечение генитального хламидиоза. Реферативное сообщение — Кольцове, 1997. — 63 с.

4. Stephens R.S. et al. Genome Sequence of an obligate intracellular pathogen of humans: Chlamydia trachomatis, Science — Jet. 1998. — Vol. 282. — P. 754-759.