ПЕРВАЯ ОТЕЧЕСТВЕННАЯ ВИДОСПЕЦИФИЧЕСКАЯ ИММУНОФЕРМЕНТНАЯ ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ IGG К CHLAMYDIA TRACHOMATIS “ХЛАМИ -IgG-ДС-Тr”.

Сборник научных трудов сотрудников НИКТИ БАВ. Бердск, 1999
И.Н. Манзенюк¹, В.И. Масычева, С.А. Федосов, М.В.Лосев ²,С.Н Гнедой³

¹Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля МБП им. Л.A. Тарасевича, ²ЗАО “МБС”, ³ООО “Биоагромед”.

По данным ВОЗ среди заболеваний, передающихся половым путем, урогенитальный хламидиоз стоит на втором месте. Более чем 89 миллионов новых случаев инфицирования Chl.trachomatis происходит ежегодно в мире. Экономический ущерб, наносимый этим заболеванием, составляет миллиарды долларов. Chl.trachomatis увеличивает риск проникновения ВИЧ-инфекции [1, 2].

Выраженный полиморфизм клинических проявлений и отсутствие опорных симптомов значительно осложняет клиническую диагностику хламидиозов. Из-за малочисленности симптомов и как следствие несвоевременности диагностики, заболевание нередко приобретает хроническое течение, приводя к развитию разнообразных осложнений [З],

Значение урогенитальных хламидиозов в инфекционной патологии человека определяется непосредственными многоочаговыми поражениями мочеполовой системы (уретритами, эпидимитами, простатитами, цервицитами, сальпингитами и т.д.). Хламидийная инфекция у женщин связана с серьезными нарушениями репродуктивной функции и инфекционными осложнениями, такими как воспалительные заболевания органов малого таза, преждевременные роды, бесплодие. Растет заболеваемость экстрагенитальным хламидиозом (проктиты, фарингиты, конъюктивиты, пневмонии новорожденных, поражение суставов - болезнь Рейтера). Широкий спектр клинической патологии, вызываемый данным возбудителем, хорошо описан в отечественной и зарубежной литературе [1,4].

Решающее значение в выявлении хламидийных инфекций принадлежит методам лабораторной диагностики. Лабораторная диагностика при хламидиозах основывается на прямом методе исследования: выявление возбудителя, его антигенов или ДНК и данных серологии: обнаружение антихламидийных антител.

Серологическая диагностика имеет второстепенное значение в диагностике острой хламидийной инфекции, когда уровни антихламидийных антител не высоки. Но она успешно применяется в случаях тяжелых воспалительных заболеваний урогенитальной сферы, в установлении диагноза хронических последствий инфекций, вызванных Chl.trachomatis (осложнений), когда другие методы лабораторной диагностики не эффективны и не выявляют антигены Chl.trachomatis или живых микроорганизмов. Современными направлениями в лабораторной диагностике Chl.trachomatis инфекции становится комплексный подход, используя комбинации различных диагностических тестов для скрининга и подтверждения.

Наша работа посвящена описанию первой отечественной иммуноферментной тест-системы для выявления IgG к Chl.trachomatis, успешно прошедшей Государственные испытания в ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА

В работе использовались экспериментально-производственные серии иммуноферментной тест-системы “Хлами-IgG-ДС-Тг”. В связи с отсутствием в России аттестованных иммуноферментных диагностических тест-систем для выявления антител класса G на хламидийные инфекции, в качестве референс-тест-системы использовали "Chlamydia trachomatis IgG ЕIA Test" Labsystems, Финляндия. Государственные испытания были проведены в ГИСК им. Л.А. Тарасовича в условиях шифрованного опыта. Материалом исследования служили сыворотки крови от больных хламидиозом или здоровых лиц, полученных в медицинских учреждениях гг. Москвы и Новосибирска.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Использование рекомбинантных белков или синтетических пептидов позволило повысить чувствительность и специфичность разработанных ИФА-тест-систем. Первой зарубежной видоспецифической ИФА-тест-системой для выявления антител к Chl.trachomatis стал коммерческий диагностикум фирмы "Лабсистемс", разработанный на основе синтетических пептидов. У данной тест-системы отсутствует перекрест к Chl. pneumonia антителам, что особенно важно, т.к. у 80-90 % людей с возрастом наблюдаются различные титры антител к этому возбудителю.

НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ “Вектор”, совместно с ЗАО “МБС” и ООО “Биоагромед” разработана тест-система для выявления специфических иммуноглобулинов G к хламидиям Chlamydia trachomatis в сыворотке крови человека методом ИФА.

В процессе разработки тест-системы была проведена сравнительная оценка различных антигенов Chlamydia trachomatis отечественного производства. Неудовлетворительное качество природных антигенов, их цельность и нестандартизованиость партий антигена, обусловило выбор в качестве сенсибилизирующего антигена - видоспецифического рекомбинантного белка Chlamydia trachomatis.

Согласно данным ряда исследователей, основной белок наружной мембраны (MOMP-Major Outer Membrane Protein) обладает выраженными иммуногенными свойствами. Он экспонирован на поверхности хламидийных клеток и составляет около 60% суммарного поверхностно белка и является принципиальным серотипирующим иммуногенным антигеном Chlamydia trachomatis. Известна полная нуклеотидная последовательность данного белка, хорошо изучена его доменная структура.

Используя генно-инженерные методы, был получен специфический рекомбинантный белок МОМР Chlamydia trachomatis серовар L2, не обладающий перекрестными реакциями с антителами к Chl.psittacy и Chl. Pneumonia

Использование высокоочищенного видоспецифического рекомбинантного антигена, позволило повысить чувствительность и специфичность тест-системы “Хлами -IgG-ДС-Tr”. Тест-система предназначена для выявления антител класса G к Chlamydia trachomatis методом непрямого иммуноферментного анализа. Контроль трех серий и проведенные Государственные испытания выявили высокую чувствительность и специфичность “Хлами -IgG-ДС-Tr”.

Материалом исследования служили сыворотки крови от больных хламидиозом или здоровых лиц. Сыворотки перед формированием были подвергнуты скринингу референс-тест-системой Labsystems, Финляндия. "Chlamydia trachomatis IgG EIA Test". Таким образом, были отобраны положительные (опытная группа) и отрицательные сыворотки (контрольная группа) с наличием или отсутствием Ig G к Chl.trachomatis.

В опытную группу были включены: сыворотки от лиц больных хламидиозом с различными поражениями внутренних органов и мочеполовой системы - 60 образцов, полученные из медицинских учреждений гг. Москвы и Новосибирска. В эту группу вошли больные с урогенитальными хламидиозами и их осложнениями (простатиты, проктиты, трубная непроходимость, эндометриты, бесплодие, эндоцервициты), больные с пневмониями и заболеваниями верхних дыхательных путей.

В контрольную группу были включены: сыворотки от больных людей с различными поражениями внутренних органов и мочеполовой системы нехламидийной этиологии (пневмонии, бронхиты, ОРЗ, артриты, гепатиты В и С, нефриты, урогенитальные инфекции нехламидийной этиологии, больные у которых этиологическим фактором заболевания являются представители хламидий других видов и т.д.) - 60 образцов . В данную группу вошли так же отрицательные сыворотки (60 сывороток здоровых людей, без клинических жалоб). Итого, данная группа представлена 120 образцами сывороток.

Государственные испытания были проведены в соответствии с требованиями контролируемого полевого опыта.

Сыворотки от лиц опытной и контрольной групп были зашифрованы сотрудниками ГИСК им. Л.А. Тарасевича и до начала работ хранились при – 20° С.

Все 180 образцов сывороток исследовали в испытуемой иммуноферментной тест-системе “Хлами-IgG -ДС - Тг” серия №18 в соответствии с инструкциями по применению. Опыты были проведены в период срока годности препаратов.

После проведения исследований сыворотки были расшифрованы и распределены на соответствующие группы для оценки чувствительности и специфичности, которая составила по отношению к референс-тест-системе 96,7%.

Испытуемая тест-система обладает хорошими эксплуатационными характеристиками: удобна в использовании, имеет низкую стоимость в сравнении с импортными аналогами, позволяет одновременно тестировать до 96 образцов, включая контроли, время постановки реакции не превышает 2-х часов, наличие цветовой реакции при внесении образцов исключает ошибки при постановке реакции, наличие стрипованного планшета дает возможность ставить реакции по мере поступления образцов, вызванных Chl.trachomatis в практической медицине. Особенно полезен этот метод для диагностики осложненных и хронических хламидийных инфекций. Наличие удобной системы интерпретации разультатов (по выявленой оптической плотности (ОП) образца), предложенной в инструкции по применению позволяет более правильно поставить диагноз и назначить соответствующее лечение.

Результаты испытания чувствительности и специфичности иммуноферментной тест-системы “Хлами-IgG-ДС-Тr” на сыворотках, предварительно отобранных с помощью референс-тест-системы  "Chlamydia trachomatis Ig G EIA Test", Финляндия.

Необходимо учитывать, что выбор метода диагностики зависит от клинической формы хламидийной инфекции. Наличие невысоких уровней IgG в сыворотке человека может свидетельствовать о ранее перенесенной инфекции, проведенной терапии антибиотиками и т.д. из-за длительного до 3-6 месяцев сохранения антител в крови. Четкое нарастание IgG в парных сыворотках в 3-4 раза от первоначального уровня свидетельствует об активном течении хламидийной инфекции. В этом случае необходимо параллельное исследование на IgA или IgM.

Высокий уровень IgA говорит либо об активном течении хламидийной инфекции или рецидиве хламидиоза. Хотя обнаружение специфических IgM антител в сыворотке пациентов ранний маркер инфекции. Создание ИФА тест-систем для детекции IgM антител наталкивается на ряд проблем. Так, циркулирующий ревматоидный фактор (IgM или IgG) обуславливает ложноположительные результаты, а негативные результаты могут быть причиной чрезмерного количества специфических IgG. В то же время IgM, часто могут не выявляться в ряде случаев у подростков и взрослых при острой инфекции, из-за предыдущего инфицирования С. trachomatis или возможно другими видами Chlamydia, такими как Chl. pneumonia. В тоже время выявление IgM к С. trachomatis является одним из основных серологических тестов для диагностики хламидийных пневмоний у новорожденных детей, а также у пациентов с LVG (венерической лимфогранулемой).